分子标记技术在烟草遗传育种中的应用

摘要：烟草是我国国民经济中一种十分重要的经济作物。尽管烟草是最早应用于分子生物学和基因工程的植物之一，但是在烟草遗传育种分子标记技术的应用远不如它在水稻、油菜广泛与深入。目前在烟草中分子标记主要用来构建遗传连锁图谱、对重要的农艺性状进行数量性状位点（QTL、quantitative trait loci）定位、与重要病害紧密连锁的分子标记获得、烟草种质资源的遗传多样性分析及转基因检测等。分子标记辅助选择（MAS，marker-assisted selection）尚未在实际的烟草育种中发挥应有的作用。但是随着我国烟草基因组计划的启动与实施，大量分子标记的开发将使其在烟草遗传育种中的作用会得到更加充分的体现，将对我国优质、抗病烟草品种的选育及烟草事业的可持续健康发展发挥着重要作用。

　　关键词：分子标记　烟草　遗传　育种　应用”

　　据统计[1]中国烟草在世界烟草格局中具有三个1/3的特征，即全球1/3的卷烟市场、全球1/3的卷烟产量、全球1/3的烟叶产量，因此，中国是世界第一烟草大国。

　　我国烟草育种工作虽然在一些方面取得了明显的成绩，但分子标记技术尚未得到深入挖掘与广泛应用，比如对一些重要性状（如抗病性、品质等）遗传规律的研究鉴定尚不够全面和系统，在功能基因定位、基因工程辅助育种等方面的研究尚未有突破性进展。同时，通过常规方法选育品种，周期太长，效率太低，而目前MAS在烟草品种选育中没得到充分运用。

　　随着分子标记种类和数量的不断增加及其在农作物遗传育种中的广泛应用（2-16），分子标记辅助选择大大缩短了品种选育时间，提高了选择的精度，极大的改良了品质，促进了农业的可持续发展。目前分子标记在烟草中的应用主要集中在种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要农艺性状的基因定位、转基因检测等方面，虽然没有取得较有突破性的研究成果，但是随着我国烟草基因组计划的迅速启动与实施，分子标记必将发挥越来越重要的作用，将开创我国烟草遗传育种工作一个全新的局面，大大促进我国烟草科技创新事业的健康长久发展。本文综述了近年来分子标记技术在烟草遗传育种方面的一些重要应用进展，旨在推动分子标记技术更好地服务于烟草育种。

　　1 分子标记在烟草遗传研究中的应用

　　烟草是细胞遗传学的模式植物，但是在分子生物学方面的研究尤其是重要农艺性状的遗传基础、遗传规律的研究尚不够深入，许多方面甚至是一片空白。由于烟草中可资利用的分子标记数量有限，而且由于狭窄的遗传背景带来的多态性表现较差，加之烟草的染色体数目较多，基因组巨大，因此到目前为止还没有一张密度较大的、完整的烟草遗传连锁图谱被报道。对烟草重要农艺性状的定位主要集中在抗病基因的QTL定位，而对其它数量性状如烟碱含量、香气香味等尚未涉及。相对而言研究开展较多的是利用分子标记对烟草种质资源进行遗传多样性分析、构建遗传指纹图谱。这些基础研究将为了解烟草最基本的特征特性与重要性状的遗传规律奠定良好的基础，对烟草品种选育与育种生产起着重要的指导作用。

　　1.1遗传图谱构建

　　目前的研究表明，栽培种烟草有48条染色体，全长约4600 MB，约为人类基因组全长的1.5倍［17］。2002年日本烟叶研究中心的学者T.Nishi等［18］利用125个白肋烟DH（doubled haploid）系所组成的DH永久性作图群体，采用117个AFLP（amplified fragment length polymorphism）分子标记构建了包含10个连锁群的遗传图谱，其总长为383CM，平均遗传距离为3.3CM。2005年美国菲莫烟草公司的Bindler等[19］利用由烟草品种Red Russian与Hicks B road Leaf所杂交、自交而成的F，分离群体，采用通过美国烟草基因组计划所开发的SSR标记（simple sequence repeats）构建了一张普通栽培烟草的遗传连锁图谱，但在这篇报告中并没有交待标记的数量与遗传图谱的长度。2006年国内学者肖炳光等［20］以烤烟品种Speight G一28和NC2326杂交经组织培养与染色体加倍技术得到的137个DH系为作图群体材料，通过ISSR（intro-simple sequence repeats）和RAPD（random amplified polymorphism DNA）标记的遗传连锁分析，构建了包括27个连锁群、由10个ISSR标记和147个RAPD标记组成的烤烟分子标记遗传连锁图。该图谱覆盖长度1838.12CM，平均图距14.1CM。这是国内外构建的第一张烤烟分子标记遗传连锁图，为烤烟性状的基因定位及分子标记辅助选择奠定了良好基础。

　　1.2烟草重要病害的分子标记分析

　　1995年Bai等［21-22]利用抗和感烟草根腐病的品种及其近等基因系找到2个与根腐病抗性基因紧密连锁的RAPD标记，经过后续的一系列片段分离与RFLP（restriction fragment length polymorphism）分析最终发现有3个片段是抗根腐病材料中所特有的。2001年郭生云等[23]用RAPD引物对抗赤星病品种和感赤星病品种进行分析，发现了一个标记与赤星病抗性基因紧密连锁，经过反复验证有较好的稳定性，可作为分子标记辅助选育抗赤星病的烤烟品种。2002年Johnson等[24]采用集团分离分析法（BSA,bulked segregation analysis）获得与烤烟品种Coke r 371-Gold的黑胫病抗性基因Ph连锁的RAPD标记。2004年刘晓侠等[25]利用红花大金元抗黑胫病的突变株系和红花大金元所获得的F2代及其双亲，采用RAPD分子标记和BSA法，找到了与烟草黑胫病抗性基因Bs1（t）连锁的RAPD标记OPB023000和OPM112500其遗传距离分别为20.5CM和29.9CM，这为该基因的进一步精细定位与图位克隆打下了良好基础。2002年日本学者T.Nishi等[18]利用白肋烟品种Burley21中感青枯病的自然突变体Michinoku和一个经多代选育而成的抗青枯病品种W6所构建的包含有125个DH系的群体，同时结合田间青枯病自然发病病情指数和AFLP分子标记对烟草中青枯病抗性性状进行了QTL分析，结果表明，存在一个主效QTL，它解释了超过30%的青枯病表型变异，该QTL所跨越的遗传距离为32CM，包含有15个AFLP分子标记。1998年Yi等[26]利用DH群体通过RAPD标记对烟草根结线虫抗性基因进行了定位分析，结果表明，有6个主要位点与该基因紧密连锁，包含了16个RAPD标记，所跨越的遗传距离为24.1CM，其中6个标记与该基因共分离。1998年Yi等[27]利用BSA法结合DH群体鉴定了5个与野火病抗性基因连锁的RAPD标记。

　　1.3种质资源的遗传多样性分析

　　烟草种质资源比较丰富，对各种类型的烟草进行多样性分析与进化分类，构建遗传指纹图谱将为鉴定不同烟草资源及充分利用烟草种质资源具有十分重要的意义。意大利烟草试验站的Piano L等利用ISSR标记构建了烟属30个种的遗传指纹图谱，研究结果也表明，ISSR标记能有效地区分不同种的烟草。2003年王志德等[28]利用RAPD标记对24个烟草核心种质进行了遗传多样性分析，构建了其遗传指纹图谱，通过聚类分析，可将24个核心种质分为6大类群，并揭示种质问的遗传差异并不完全取决于栽培类型间的差异，而与种质问演化关系有关，野生种与栽培种间存在较大的遗传差异。2005年杨本超等[29]利用ISSR标记对24份烤烟资源进行了遗传多样性分析，结果表明，这24份烤烟资源可以分为5类，同时每个品种都有各自独特的指纹图谱，再次证实了ISSR标记适于烟草品种鉴定与遗传多样性研究。2005年美国菲莫烟草公司的Bindler等[19]利用200个SSR标记构建了众多烟草种质资源的遗传指纹图谱，其中有一个标记能很好的区分白肋烟、烤烟、东方烟草类型及另外60个重要烟草种质资源。2006年杨友才等[30]选用4对AFLP标记对48份烟草种质资源进行了聚类分析，结果表明这48份材料可分为两大类，即黄花烟草群与普通烟草群，后者进一步可分为4组，由此说明，AFLP标记技术能较好地从分子水平上揭示中国烟草种质资源的遗传背景亲缘关系及演化规律。2006年祁建民等[31]利用ISSR标记对烟草属4个种30份材料的遗传多样性进行了分析，结果表明，可将该30份材料在D=0.475时分为2个大类、3小类及6个独立的个类，较好的揭示了烟草属种间或栽培品种类型间的遗传多样性与亲缘关系。在烟草品种的DNA指纹图谱构建与品种特性鉴定等方面[32-35]国内众多学者开展了不少工作，涉及的烟草品种与类型也较多，有利于了解我国烟草资源之间的亲缘关系。

　　1.4转基因检测

　　烟草是一种优良的转基因受体材料，技术十分成熟，很容易获得转化植株。在转基因检测技术中，除了GUS报告基因法、Southern杂交、表型功能鉴定等之外还可利用能扩增目标基因的特异引物进行分子标记鉴定，从DNA水平上快速证实目标基因是否已经转入受体材料。

　　2005年林国平等[36]将具有广谱抗病的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GO）基因及抗虫半夏凝集素（Pinella Temata Agglutinin,PTA）基因转化到白肋烟中，利用能扩增GO基因与PTA基因的两个特异引物对白肋烟转化植株进行了检测，分子标记检测结果表明这两个目标基因已经转入受体植株中。2005年郭兆奎等[37]将拟南芥中编码高亲和性K+载体蛋白基因AtKup1通过农杆菌介导的方法转入烟草中，该基因的特异引物检测表明该基因已经转入受体材料中，而且钾含量检测结果也显示含钾量提高了约45%。

　　2 分子标记在烟草育种中的应用

　　就目前被报道的文献来看，分子标记辅助选择在烟草育种中的利用情况并不多见，其中重要原因是烟草中大多数农艺性状表现数量性状遗传的特征，群体中表型分离情况较为复杂，能用于MAS的分子标记也较少，而且即使如抗病等呈现质量性状特点的性状在不同的材料中可能相关基因也有所不同，可能同属于一个基因家族的不同成员，因此找到的可用于MAS的分子标记很难具备广泛的适用性。2002年Johnson等[38]利用与烤烟品种Coker 371-Gold的黑胫病抗性基因Ph紧密连锁的RAPD标记结合温室接种鉴定结果验证MAS的准确性，结果表明，在对多代回交后代分析中发现分子标记检测的结果与相应材料的黑胫病抗性结果高度一致，这充分证明了MAS用于育种的高效性与可靠性。

　　3 分子标记在烟草遗传育种中的应用展望

　　DNA水平上不同材料遗传多样性的直接表现，其多样性表现为核苷酸序列的差异，因此，它的数量是无限的。主要的优点是无表型效应，不受环境条件的影响，准确性高，任何组织的样品均能代表整体等。目前分子标记已广泛应用于作物种质资源遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助选择等方面。

　　随着中国烟草基因组计划的迅速启动与实施，将有大量单核苷酸序列多态性标记（SNP，single nucleotide polymorphism）被开发出来，打破现有分子标记在烟草中多态性较差的瓶颈，而且可利用大量的表达序列标签（EST，expressed sequence tags）开发保守性较好、共显性的SSR标记。高密度遗传图谱的构建将为控制烟草重要农艺性状尤其是数量性状如烟碱含量、香气、产量等基因的精细定位与图位克隆奠定扎实的基础，通过其他标记转化为可有效用于分子标记辅助选育的SCAR（sequence characterized amplified region）标记，为新品种培育节省时间，提高精确度，利用分子标记对所有烟草种质资源进行系统的进化分类，构建完善的、可靠的遗传指纹图谱，彻底了解众多烟草资源的特征特性，对资源进行有效整合，为更好的利用现有种质资源提充足的供科学依据。

　　根据目前我国烟叶生产中存在的主要问题，比如烟碱含量居高不下，品种综合抗病能力差，抗病与品质相矛盾，亲本资源较少，香气香味特征不明显等，我们应利用分子标记开展以下几项工作。第一，利用丰富的分子标记资源构建烤烟、白肋烟等种质可公用的、统一的高密度遗传图谱，并随着分子标记数量的不断增多而不断增加该图谱的标记密度，同时开展不同种烟草的共线性和同线性研究，寻找同源区域，了解烟草种质的进化信息。统一的高密度的遗传图谱可用来进行基因定位与图谱克隆，并能对各科研单位的遗传图谱进行有效的比较与整合，了解不同品种之间的差异。第二，通过基因定位工作寻找与重要农艺性状紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助育种，比如在苗期甚至种子就可以检测出哪些单株或种子含有控制烟碱含量的基因从而节省了育种时间，也可以用于雄性不育系回交转育后代的鉴定，聚合育种的后代选择等，提高了选育的可靠性，为培育适合卷烟工业所需求的品种，提供优质烟叶原材料提高了可靠的保证。第三，对转基因品种检测工作的进一步重视。烟草是细胞遗传学的模式植物，其转基因技术已经十分成熟，是优良的转化受体，而且也是很好的生物反应器，但由于转基因烟草目前只限于实验室研究，有严格的环境释放规定，转基因烟草品种检测方面的工作经验不够丰富，因此需利用分子标记技术深入其安全性的评估和方法方面的研究工作，为将来优质抗病等综合性状优良的转基因产品可能的推广应用做好准备与提供科学依据。责任编辑：程汉松

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