植物转基因沉默

                                   (北京师范大学生命科学学院，北京 100875)
摘 要：在农林牧业生产中，植物转基因沉默是造成转基因植物非孟德尔遗传的主要原因，对于转基因作物的利用产生了非常不利的影响，已成为影响转基因技术推广应用的主要问题之一，本文通过从外源基因转化前的防止及转化后的抑制两方面就目前常用的策略做一总结。
关键词：转基因沉默；植物；遗传
中图分类号：Q943.2  文献标识码：A  文章编号：1007—6921(2007)08—0077—04
      自1983 年世界第一株转基因烟草诞生至今，外源基因可以通过不同的转化方法进入植物基因组整合并且表达，目前已有种。可以说，目前基因的转化方法已不再是转基因的吸纳之因素，然而由于外源基因在植物体内的地遗传性为非常复杂，因此转基因能否在植物体内稳定的整合、遗传和表达就决定了转基因植物的使用价值。转基因植物的外源基因的遗传行为与经典遗传规律差异很大，基因的分离表现为非孟德尔遗传，而当以转基因的表型分离比确定转基因的遗传类型时，转基因沉默是造成非孟德尔遗传的首要原因。转基因诱导的基因沉默是植物遗传转化过程中的普遍发生，在谷类中，有超过50%的转基因在世代传递过程中发生基因沉默。可见，转基因沉默已经成为阻碍转基因技术推广应用的主要问题之一。
      人们对植物转基因沉默的机制已有一些了解，但总的来说还比较零散，尚不成系统，仍有许多问题需要解决。目前，植物转基因沉默的分类主要有两种分类方法：一类是将其分为位置依赖性沉默(SDS)和同源依赖性沉默（HDGS）；另一类是分为转录水平沉默(TGS)和转录后水平沉默(PTGS)。可这两类分类系统相互包含，并不是很好的分类方法。这种混乱的情况可能也说明植物转基因沉默机制的复杂性尚未被人类揭晓。但是，人们并不能因此停止对转基因植物的研究，因此如何利用现在已经掌握的一些关于转基因沉默的机制从而抑制转基因植物发生基因沉默对于人类能否更好的使用转基因植物具有重要意义。关于植物转基因沉默的优秀综述非常多，因此本文主要以转基因沉默抑制策略出发，在详述抑制策略的过程中穿插一些关于植物转基因沉默的机制研究现状。根据转基因沉默抑制策略的时间先后，可以将抑制策略大致分为转化前防止与转化后抑制。
1 外源基因转化前防止策略
      转化前抑制是指在将外源基因转入植物之前，修饰外源基因，选择适当的转导方法，以达到优化外源基因密码子、避免同源序列等目的，从而避免植物自身发生转基因沉默或者降低其发生转基因沉默的概率。
1.1 避免使用同源序列
      同源序列是公认的产生转基因沉默的主要诱因，其转录可能会造成某种内源mRNA的过表达，从而导致RdRP被激活，由于RdRP能够指导不依赖引物的RNA互补链的合成，从而产生dsRNA，进而发生RNA沉默。如1990年，Jorgenson等人试图将查耳酮合成酶基因转入紫花矮牵牛中以加深其颜色，但结果却显示一些花色不但没有加深，反而表现为杂色，甚至纯白色。这可能就是由于同源序列使得内源基因和外源基因被同时沉默的共抑制现象。因此，在构建表达载体时，应尽量降低所设计序列与宿主植物内源基因的同源性，从而避免共抑制现象的发生。
1.2 修饰外源基因
      由于对于某种植物，其基因组中所含有的碱基组成比较固定，或者富含GC，或者富含AT。而GC或AT的含量在不同种间又具有差异，称为GC等容线（isochore），因此，如果外源基因整合到植物DNA上后，会受到两侧DNA序列的影响。如果外源基因的GC含量与整合位点差异较大，就会因此而被识别，造成外源基因DNA的甲基化，从而关闭基因的，发生转基因沉默。如玉米中AL基因的GC含量为52.5%，而在转AL基因沉默的矮牵牛中，AL基因两侧DNA序列的GC含量分别为26%和23%，明显低于52.5%，检测到AL基因超甲基化，然而其两侧DNA的甲基化程度则不高。这说明，植物体内有一套识别系统能够通过比较外源基因与两侧DNA的GC含量来识别外源基因，进而激活甲基化酶，使外源基因甲基化。Perlak F.J.在培育抗虫棉BT时，通过改变其HD-1和HD-73内毒素基因的密码使用，使GC含量提高，并去除一些AT序列，从而得到了无转基因沉默的抗鳞翅目一些昆虫的抗虫棉，这种抗虫棉已于1996年大规模种植。
1.3 选择偏爱密码子
      基因的高效表达除了还与载体生物使用的密码子及tRNA的数量匹配关系有关。这主要有以下三个原因。第一，虽然对于所有生物来说其密码子基本相同，但是对于不同种属的生物，还是存在偏爱的密码子，而且其偏爱的程度各不相同。例如：E.coli中很少使用AGG、CGA和CGG。在编码Arg时，由于E. coli中与AGG相应的tRNA数量很少而造成含AGG密码子的外源基因低效表达。第二，基因碱基的配对是可以移动的，不过这种移动是有一定规则的，而且不同的生物遵循规则并不完全一致。第三，不同种类的生物含有不同种类的tRNA，不同tRNA解读密码子的能力并不相同。因此外源基因进入宿主基因组后，被正确解读的几率发生差别，也有可能导致基因沉默。例如：在拟南芥有6个主要的谷氨酰胺酶(Gln)基因：Gln1-5基因产生的是谷氨酰胺酶(GS-1)与Gln-6产生的谷氨酰胺酶(Gln-2)是二个同工酶，这几个基因的密码不一样。因此，优化密码子，使用宿主植物偏爱的密码子，使转入的外源基因的密码子能够适应宿主植物的tRNA，也是避免基因沉默的一个策略。
1.4 使用核基质结合序列
      核基质结合序列MAR(matrix attachment region)，又称核骨架结合区SAR(scaffordattachment region)，是染色质上的一段序列，长度一般为300～1 000bp，通常富含AT，它可以与核骨架相结合。两个MAR之间的染色质区域可形成大小为5～200Kb的DNA环，构成一个独立的表达结构。利用MAR的这个特点，在转基因的两侧翼接上MAR序列，MAR通过对染色质结构的直接限制，使转基因不能形成稳定的凝聚染色质结构，从而保证了转录的正常进行，并使染色质处于开放模式——使RNA聚合酶容易接近这种结构——从而提高了转基因的表达效率。另外，由于MAR能使转基因形成一个独立区域，不受周围染色质顺式调控元件的影响，使相
邻的转录单元保持相对的独立性，从而使转基因稳定表达，消除外源基因由于位置效应而被沉默。
      近来多项研究表明：利用MAR与转基因构件转化载体协同转化植物后，转基因植物中转基因的表达量大幅度提高，同时避免了转基因的位置效应和转基因的沉默。如MAR序列的存在可以有效地缩小β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因在转基因植物当代和子代表达的变化程度。在外源基因不超过40个拷贝数的情况下，MAR的存在可以显著降低共抑制效应。在转基因杨树中，烟草MAR序列的存在可以使GUS表达量平均提高10倍，并且可提高抗性芽产生的频率。
1.5 利用优良的转化和重组系统
      例如：基于AC/DS转座系统建立的转化载体，Lebel等人借助于该系统，通过基因直接转化法，把10kb的大片段以完整单拷贝的方式整合进受体细胞基因组；利用酵母线粒体Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，特异性断裂植物DNA双链的同源重组系统，将外源DNA整合到染色体的特定位点上：Puchta等利用该系统发现，通过利用该系统能使在特定位点的同源重组频率增加2个级别，因此我们可以利用这种系统，利用转基因与内源基因间的同源性，在特定位点用转基因来置换内源基因，从而来避免共抑制现象的发生；利用双元细菌人工染色载体系统(binary bacterial artificial chromosome，BIBAC)稳定整合大片段外源DNA到宿主基因组中：Hamilton等报道，利用BIBAC载体把150kb的外源DNA整合到烟草中，并且整合的完整外源DNA能在后代中稳定遗传；利用细菌噬菌体P1Cre-lox，酿酒酵母FLPfrt和结合酵母Rrs位点特异性重组系统，这类系统可将外源基因以单拷贝，位点特异的方式整合到事先整合有lox，FRT，rs位点的植物上：Albert，Vergunst等两个研究小组先后成功地利用细菌噬菌体P1Cre-lox系统将T-DNA以单拷贝、位点特异的方式整合到烟草和拟南介中，实现了转基因的稳定表达利用具有新型筛选标记基因的转化载体，如磷酸甘露糖异构酶。这类载体转化效率高，对细胞生长具无害性，有利于转基因植株的高效表达。
1.6 选择合适的转化方法
      目前，植物基因工程种外源基因的转化方法非常多，常用的有农杆菌介导法和基因枪法。在真核生物的染色体中，染色体的末端富含常染色质，属于基因富含区；近着丝粒区则相反，富含异染色质，活性基因稀少，这种染色体水平上的修饰产生后成状态，并不必需要甲基化。例如，在酵母和果蝇中，转基因沉默往往起因于异染色质化，而大多数高等植物基因组中除着丝粒和端粒外，中间区也含有大量的异染色质和重复DNA。
      由于基因枪法所转入的外源基因容易落于异染色质区域，而农杆菌介导法导入的基因多进入染色体的末端，所以为了能够使得外源基因正常表达，农杆菌介导法明显优于基因枪法。另外，基因枪法导入的外源基因为多拷贝，而农杆菌介导法能够减少导入外源基因的拷贝数，减少多拷贝植株的数量，并且已经可以实现外源基因的单拷贝，从而避免重复序列产生的基因沉默现象。由于多拷贝的外源基因以正向或者反向串连的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活，叫做重复诱导的基因沉默（RIGS）。
      高等生物基因组含有大量重复序列及多拷贝基因，但这些重复序列并未发生失活现象，可见其自身的重复序列并无影响。然而外源基因拷贝数的多少能在不同程度上造成转基因失活。如果重复序列串联或者紧密连锁在在一起就形成顺式失活(cis-inactivation)；由于重复序列位于染色体的不同位置所会造成反式失活(trans-inactivation)。其中反式失活是指某一基因的失活状态引起同源的等位基因或非等位基因的失活。启动子区域只要有90bp的同源性就可以引起基因间的反式失活。
      多拷贝重复基因序列整合进基因组后，无论正、反以及是紧密相连还是被其他序列隔开都可以进行DNA-DNA 的异位配对(ectopicpairing)，Assaad推测可能是异位配对造成染色体构型发生变化，引起基因组防御系统的识别，使重复顺序位点染色质发生收缩(异染色质化)，从空间上阻碍了转录因子与转基因的接触使基因处于关闭状态从而失活，但其详细机制目前仍不清楚。如Dieguez等将正、反向重复GUS基因分别导入能表达GUS基因的水稻品种中去后，产生基因沉默的频率依次增加。绝大部分发生沉默的株系中， 均产生严重的甲基化现象，而且越接近反向重复序列中心， 其甲基化程度越严重。没有发生沉默的株系中， 则未发现甲基化现象。另外，当外源基因被转入拟南芥中后，若是多拷贝的转入则重复序列就成为甲基化的目标，而且转入的序列与拟南芥的同源部分也会被甲基化。但是，农杆菌接到转化法也比较容易导致基因沉默。吴刚等成功地利用农杆菌介导法实现了BT cry 1Ab1基因对水稻的转化后，也发现cry 1Ab1基因在转基因水稻后代发生了沉默。
      因此，为了根除转基因沉默，还要采用一些最近发展起来的转基因方法，以实现转基因位点专一且单拷贝插入，也即定点插入法。另外，定点插入法还能选择与外源基因GC含量近似的
位点插入外源基因，从而避免因为GC含量差异造成的转基因沉默。
1.7 选择单拷贝转基因植株
      单拷贝个体的筛选可以在分子水平进行，如利用southern杂交，反向PCR来确定；也可以在育种过程中进行，如采用常规的杂交、回交等方式，通过分析后代分离比来确定。筛选到单拷贝基因个体后，要对转基因纯合株系转基因表达的稳定性进行鉴定。可以通过组培来了解环境胁迫引起的转基因的甲基化，并结合不同田间条件及不同遗传背景开展转基因表达稳定性的鉴定。从而达到防止子代出现转基因沉默的目的。
2 外源基因转化后抑制策略
2.1 去甲基化
      无论是转录水平基因沉默还是转录后水平基因沉默，到目前为止研究过的大多数沉默现象都与基因的甲基化密切相关。最近研究表明：甲基化均是从启动子区与开始的，可延伸至转基因的3′端，发生在DNA的CG和CNG序列上的胞嘧啶甲基化并不是植物转基因转录水平沉默的前提，但胞嘧啶甲基化对维持转基因沉默是必需的。一方面，由于外源基因的插入可能被系统中一种尚不知道的机制识别从而导致其甲基化，另一方面，在PTGS过程中产生的rasi RNA也能够对染色质进行化学修饰——胞嘧啶甲基化，这称为RNA导向的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）。并且，与基因启动子区同源的ds RNA已经被证实能够诱发RdDM，导致TGS。
      综上所述，对于已经发生转基因沉默的植株通过采取去甲基化的措施可以是沉默的基因重新表达。主要的去甲基化试剂主要是二羟基丙基腺嘌呤或5-氮胞苷，经过它们处理可使转基因序列非编码区约30%的胞嘧啶去甲基化，转基因水平相应提高12倍，但这类试剂使转基因植物普遍出现各种不利性状，因此在使用方法、用量、时间等反面应做进一步的研究，尽量减少不利影响。吴刚等在对Bt cry 1Ab1转基因沉默水稻的研究中发现：5-氮胞苷虽然能使10%左右的转基因沉默植物恢复表达火星，但是经5-氮胞苷处理过的转基因水稻普遍出现植株矮小、结实率低、分蘖数大幅下降和生育期延迟等不利性状。且5-氮胞苷价格昂贵并具有致癌性，实用价值并不高。
2.2 去除MOM基因
      启动子序列的甲基化会导致TGS，而编码序列的甲基化会导致PTGS。而且随着转化细胞代数的增加，DNA甲基化缓慢变化，从3′区或编码区域逐渐引入到启动子区域，最终导致该基因的不可逆的表达关闭。因此甲基化现象有时不可避免，而去除甲基化的使用价值不高，因此寻找其它消除沉默的方法很重要。MOM是一种编码核蛋白的基因，参与染色质重构(remodelling) 。已有报道用突变MOM基因或通过其反义RNA的表达来消除MOM的转录的mRNA，可以使几种已经沉默的高度甲基化的位点恢复转录活性，而这些被恢复的位点可以维持9代。最近发现拟南芥TGS水平沉默的释放有两个水平，一个是依赖甲基化水平，即DDM1突变株表现出的
去甲基化，另一个是不依赖甲基化水平，即MOM1突变株表现出的不影响甲基化。两者的关系是，后者是对前者的加强，尤其在甲基化缺失时，防止外遗传失控的情况出现。再次证实去除MOM，确实能够消除TGS水平的沉默现象。
2.3 甲基化作用相关基因的去除
      既然基因沉默大多数情况下是与DNA序列甲基化有关，那么可以将与甲基化有关的基因去除，或者使其沉默从而消除其他转基因的沉默。如DNA甲基化转移酶(Mtase)与转基因沉默有关，用RNAi技术去除水稻( Oryza sativa L.)中的OsMET121和OsMET122酶，能消除由于甲基化导致的转基因沉默。又如拟南芥中发现12种，编码类似动物的甲基化2CpG2结合区域(MBD)的蛋白，其中ArMBD11基因的缺失可以使转基因沉默消失。但是，基因敲除方法的可行性有待探索，即去除某些与沉默有关基因后对机体的正常生理活动有无重大影响需要进一步鉴定。
2.4 病毒抑制因子
      在病毒与植物长期的协同进化过程中，植物通过PTGS机制对病毒产生抗性，而病毒也进化出抑制PTGS的蛋白抑制因子，能抑制PTGS的启动和保持以及传导。因此，一些病毒的蛋白因子可以用来抑制植物转基因沉默。
2.5 烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）
      Kristin等1998年发现了这种植物基因沉默抑制子，目前已从多方面的实验证明了其对基因沉默的抑制作用。基因沉默的病毒抑制子包括：烟草蚀刻病毒基因组RNA编码蛋白P1的5端区域，HC-Pro蛋白(由马铃薯Y病毒、水稻斑驳病、南方菜豆花叶病毒和非洲木薯花叶双生病毒编码)以及蛋白P3的一小部分，因此被叫做P1／HC-Pro序列。
      据Mallory等分析，在转基因烟草的基因沉默中，si RNA可以和3种不同形式转入的外源基因发生应答：正义序列、反义重复序列和扩增子序列，而HC-Pro抑制这3种形式转入的基因发生沉默，阻止相关si RNA的积累，但是并不抑制已经沉默部位的si RNA的积累。通过对ds RNA的积累量进行分析，发现HC-Pro对RNA沉默的抑制包括对si RNA生成过程的抑制，或者使si RNA发生变化。研究结果表明，HC-Pro可以改变植物体内小RNA的代谢，对不同种小RNA的积累进行不同的调控。但是，通过嫁接实验证明HC-Pro并不能抑制造成系统性沉默的移动沉默信号分子的产生和传导，说明HC-Pro作用于PTGS的持续阶段。另外，对于HC-Pro能够消除甲基化由于人们的实验方法及标准不同，尚无定论。农杆菌介导的HC-Pro的瞬时表达体系中，Anandalakshmi等人发现，HC-Pro可以抑制转GUS基因烟草(N．tabacum)的RNA沉默。
2.6 黄瓜花叶病毒蛋白（CMV2b）
      转GFP烟草实验证实：CMV2b的表达，可以导致GFP基因沉默后的叶片在生长点处有GFP的重新表达。而在旧有的叶片组织中，由于在病毒浸染前已经诱导产生了RNA沉默，因此不能重新出现GFP的表达。由此可见，CMV2b作为病毒抑制子，可以有效地抑制系统沉默信号传递到新生组织中，因此抑制新生组织的基因沉默。进一步研究发现，外部信号进入CMV2b表达的细胞内并不能有效地触发对目标RNA的降解。另外，CMV2b抑"D7制可影响信号的活性，同时干涉核内aDNA的甲基化。但是CMV2b对细胞内基因沉默的抑制是不完全的，它并不阻止转入的GUS基因沉默的产生，它只阻止转录后基因沉默在细胞内的传递和信号的调节。
2.7 马铃薯X 病毒蛋白（P25）
      研究证明，PVX表达的25kD蛋白即P25蛋白是影响RNA系统沉默信号的元凶。有趣的是，虽然P25能够通过阻止基因沉默的诱导物(例如拟南芥中的SDE一1)阻止系统信号的产生，但它却只能作用于由35S-GFP诱导的转录后基因沉默，而对由病毒载体35S-PVX-GFP诱导的基因沉默不起作用。因此，P25对于育种的使用价值并不是很大，但它对于研究移动沉默信号的信号分子以及其作用机制有重要意义。另外，其他一些病毒蛋白如番茄丛矮病毒蛋白P19，ToMV-RR及TYLCU-C病毒蛋白C2都可以用于抑制转基因植物的RNA沉默。
3 总结
      植物转基因沉默的机制尚未被人们完全掌握，但是通过一些的策略和方法，人们已经能够防止或者抑制转基因沉默的发生。另外，植物转基因沉默的诱因除了基因本身之外，环境因素对于转基因沉默的发生也有一定的影响，进一步如何摸索环境因素也是攻破植物转基因沉默的一个重要方面。虽然这些策略和方法尚未成熟，但已经能发现，获得稳定遗传的转基因植物其经济价值非常高，同时这也为人类解决生存问题提供了新的工具，因此仍需要人们进一步的探索。
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