专题5-课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段-教案

　专题 5

　DNA 和蛋白质技术 课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 1.

　教学目标

　1、了解 PCR 技术的基本操作 2、理解 PCR 的原理 3、讨论 PCR 的应用 2.

　教学重点/ / 难点

　教学重点：PCR 的原理和 PCR 的基本操作 教学难点：PCR 的原理 3.

　教学用具

　教学课件 教学过程

　（一）引入新课

　1、组成元素：C、H、O、N、P 2、基本单位: 脱氧核苷酸 3、脱氧核苷酸结构 （二）、细胞内的 A DNA 复制 1、概念：由一个 DNA 形成两个完全相同的 DNA 的过程 2、时期：有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期 3、场所：细胞核（主）、线粒体、叶绿体 4、模板：DNA 母链 5、原材料：脱氧核苷酸 6、基本条件:酶、ATP、原料、模板 7、复制过程: ① DNA 的解旋

　 ② RNA 引物的合成 ③ DNA 的生成

　 ④切掉引物生成冈崎片断

　⑤ DNA 片断的连接 8、复制特点: 边解旋边复制(过程）、半保留复制（结果）

　9、遵循原则：碱基互补配对原则 10、精确复制的原因：

　①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板

　②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 （三）、聚合酶链式反应 PCR 是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟 DNA 体内复制的 DNA 快速扩增的方法，此技术获得 1993 年诺贝尔化学奖。

　1．PCR 原理 PCR 技术扩增 DNA 的过程，与细胞内 DNA 复制过程类似：

　1．1 细胞内 DNA 复制条件分析：

　1．2 细胞内 DNA 复制过程 （1）DNA 的反向平行结构：（结合教材图 5－6）

　核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

　由核苷酸通过 3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

　DNA 双螺旋结构的反向平行结构：

　（2）DNA 的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA 两条链打开，，形成两条 DNA 单链。

　引物结合：在 DNA 单链 3’端与 DNA 反向配对结合，确保引物 3’端与 DNA 单链准确配对。

　DNA 聚合酶结合：

　子链合成：DNA 聚合酶从引物 3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

　后续加工：DNA 聚合酶 I 将引物切去，并合成空缺处的 DNA 单链，再由 DNA 连接酶将不连续的 DNA 子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

　子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

　感悟生命的神秘：DNA 聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此 RNA 的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA 引物完成功能后即被 DNA 聚合酶 I 删去，代之以高保真的 DNA 链。

　［思考］DNA 分子能准确复制的原因有哪些？ DNA 双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA 聚合酶的复查功能。

　［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA 合成、蛋白质合成。

　1．3

　DNA 分子复制的人工控制 解开螺旋：在 80～100℃时，DNA 双螺旋打开，形成两条 DNA 单链，称为变性。

　恢复螺旋：在 50℃左右时，两条 DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

　复制条件：缓冲液,DNA 模板,四种脱氧核苷酸,热稳定 DNA 聚合酶,两种引物。

　反应场所：PCR 仪（自动温度周期性调节）。

　［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

　2．PCR 的反应过程

　变性：在 95℃时 DNA 解旋 复性：在 50℃时引物与 DNA 单链结合 延伸：在 72℃时合成 DNA 子链（两个引物间的序列）

　3．实验操作 3．1 PCR 反应体系：

　缓冲液、DNA 模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定 DNA 聚合酶、两种 RNA 引物，水 3．2 实验操作步骤 3．3 按照 PCR 反应体系配方配制反应液； （1）将 PCR 反应体系 50μL 用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中； （2）将微量离心管放到 PCR 仪中； （3）设置 PCR 仪的工作参数。

　（4）DNA 在 PCR 仪中大量扩增。

　3．4 水浴法：将微型离心管依次在 95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

　4．实验注意事项 （1）避免外源 DNA 污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

　（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

　（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

　（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

　5．结果分析与评价 （1）反应液稀释：取 2µLPCR 反应液，添加 98µL 蒸馏水；2．分光光度计调零：将 100µL 蒸

　馏水添加到比色杯中，在 260nm 处将分光光度计调整读数为零。

　（2）将 100µL 反应稀释液倒入比色杯中，测定在 260nm 处的光吸收值。

　（3）计算：DNA 含量＝50×光吸收值×稀释倍数 （四）、R PCR 产物鉴定：

　琼脂糖凝胶电泳技术 1、实验原理 在外加电场的作用下，带电粒子发生迁移的现象叫电泳。在电场中，带电分子向着与其所带电荷相反的电极移动。

　在施以一定强度的电场中，带负电荷的 DNA 在琼脂糖凝胶中可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与 DNA 片段的长度成负相关，与电压强度成正比，利用这一性质可以分离不同长琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物：

　（1）制胶

　（2）点样

　（3）电泳 （4）紫外投射分析仪观察并照相 2、两种染料：

　6×上样 buffer：维持反应体系的 pH 不变，而且上样 buffer 常以溴酚蓝为指示剂，稀释成 1×后比重仍然较大，上样时极易下沉，且颜色清晰可见。

　DNA 荧光染料：由于 DNA 不能直接观察到，所以利用一种核酸的荧光染料与 PCR 的产物 DNA结合后再电泳，电泳结束后，可用紫外透射分析仪观察电泳结果。

　3、可以用已知长度的 DNA “Marker”作为参照，对电泳图谱进行比对，估算未知 DNA 分子的长度，同时根据带的宽度，估算未知 DNA 分子的数目。

　（五）、R PCR 的应用 PCR 具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR 技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。

　课堂小结

　 PCR 的技术，需要首先了解细胞内参与 DNA 复制的各种组成成分与反应条件。掌握 PCR 的基本步骤及每个步骤所发生的变化。这部分内容的应以读图识图为主。在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不

　开对 DNA 分子碱基序列的分析。而分析 DNA 碱基序列，就需要一定量的 DNA 片段。今天我们来学习研究了 DNA 分子的扩增技术――PCR 技术。希望大家能够掌握和理解。

　板书

　专题五

　第 2 节

　 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段 一、细胞内的 DNA 复制 二、聚合酶链式反应 1、PCR 扩增的原理 2、PCR 扩增的过程 三、PCR 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳技术 四、PCR 的应用

推荐访问:链式反应 扩增 教案