专题2-课题3-分解纤维素微生物分离-教案

　专题 2

　微生物的培养与应用 课题 3 分解纤维素的微生物的分离 【学习目标】

　1、了解纤维素与纤维素酶。

　2、理解纤维素分解菌的筛选原理。(重点) 3、简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。

　一、纤维素分解菌的筛选的原理 1、纤维素 纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

　(1)元素组成：C、H、O 三种元素。

　(2)组成单体：葡萄糖。

　(3)种类：除天然纤维素外，还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。

　2、纤维素酶 (1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它至少包括三种组分，包括 C 1 酶、C X 酶和葡萄糖苷酶三种组分。

　(2)作用 纤维素―――――――→C 1 酶、C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖 (3)实验验证 试管 滤纸条 缓冲溶液

　纤维素酶 (70～ 80 U/mL) 条件 结果

　1 1×6 cm pH＝4.8 的 0.1 mol/L醋酸—醋酸钠缓冲溶液 10 mL 1 mL 两试管固定在 50 mL 锥形瓶中，在摇床上以140 r/min 的转速振荡反应 1 h 时间足够长，滤纸被完全分解 2 1×6 cm pH＝4.8 的 0.1 mol/L醋酸—醋酸钠缓冲溶液 11 mL 基本无变化 ①1 个酶活力单位是指在温度为 25 ℃，其他反应条件最适宜情况下，在 1 min 内转化 1_mmol 的底物所需要的酶量。

　②实验是如何构成对照的？ 答案 在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的 pH。

　3.纤维素分解菌的筛选 (1)方法：刚果红染色法。

　常用的有两种方法，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

　(2)原理：刚果红＋纤维素→红色复合物 ――→纤维素酶 纤维素被分解，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

　（3）两种刚果红(CR)染色法的比较

　方法一 方法二 过程 培养基经涂布培养长出菌落→覆盖质量浓度为 1 mg/mL 的 CR 溶液 ―――――→10～15 min后倒去CR 溶液→加入物质的量浓度为 1 mol/L 的NaCl 溶液 ――→15 min后倒掉 NaCl 溶液→出现透明圈 配制质量浓度为 10 mg/mL 的 CR 溶液→灭菌→按照每 200 mL 培养基加入 1 mL 的比例加入 CR 溶液→混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈

　区别 先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应 倒平板时就加入刚果红 优点 显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 操作简便，不存在菌落混杂问题 缺点 操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂 ①由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 ②有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈

　二、实验设计与操作提示 1.实验过程分析 土壤取样 ：选择富含纤维素 的环境 ↓  目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从 样品中分离到所需要的微生物操作方法：将20克土样，在无菌条件下加入 装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将瓶 固定在摇床上，在一定温度下震荡培养 1～2 d，直到培养液变混浊，也可重复选择 培养 ↓ 梯度稀释 ↓ 涂布培养 ：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 ↓

　筛选菌株 ：刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落 ↓ 纯化培养 2.两种培养基 纤维素分解菌的选择培养基配方 1 纤维素粉 5 g NaNO 3

　1 g Na 2 HPO 4 ·7H 2 O 1.2 g KH 2 PO 4

　0.9 g MgSO 4 ·7H 2 O 0.5 g KCl 0.5 g 酵母膏 0.5 g 水解酪素 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到 1 000 mL

　鉴别纤维素分解菌的培养基配方 2 CMC－Na 5～10 g 酵母膏 1 g KH 2 PO 4

　0.25 g 琼脂 15 g 土豆汁 100 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到 1 000 mL (1)从功能上来看，培养基配方 1 为纤维素分解菌的选择培养基，该培养基中的唯一碳源是纤维素粉，只有能利用它的纤维素分解菌才能生存；培养基配方 2 为纤维素分解菌的鉴别培养基。在该培养基中加入刚果红溶液，当培养基中长出菌落后，由于在该培养基上生长的只能是纤维素分解

　菌，能分泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

　(2)从物理性质上来看，培养基配方 1 为纤维素分解菌的液体培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度；培养基配方 2 为纤维素分解菌的固体培养基，原因是添加了琼脂成分，需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

　(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

　3.结果分析与评价 (1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

　(2)选择培养基是否筛选出菌落：如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

　(3)分解的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

　4.课题延伸 (1)为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

　(2)纤维素酶的测定方法：一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖含量进行定量测定。

　归纳提炼 纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的区别 (1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。

　(2)能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常生长。

　(3)鉴别培养基中含有琼脂，为固体培养基，刚果红染色法应用的就是此培养基。

推荐访问:纤维素 微生物 分解