氨氮对萼花臂尾轮虫的急性毒性及其抗氧化生理响应

材料与方法

1.1 材料来源及培养

试验用萼花臂尾轮虫采集于太湖水体，在解剖镜下观察载玻片上的轮虫种类，经确认后再用微吸管吸入500 ml三角锥形瓶中，采用“单克隆”方法进行预培养[6]。轮虫的培养条件为：水温（25±l） ℃、光照强度90 μmol/（m2·s）、光照周期L∶D=12∶12、pH 7.0～8.0，培养过程中投喂椭圆小球藻，密度为2×106个/ml，每天观察轮虫生长情况。

1.2 方法

1.2.1 氨氮浓度对轮虫的急性毒性试验。 根据氨氮对轮虫急性毒性的预试验结果，设定6个氨氮质量浓度（NH3N）组为：1.5、2.5、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mg/L，用NH4Cl（分析纯）配制，另设置1个对照组（未添加氨氮），每个组设置4个平行重复。用吸管随机吸取预培养三角锥形瓶中不带卵、个体较大、游动活跃的萼花臂尾轮虫，置于含不同氨氮浓度梯度的微孔培养板中，每孔含10个轮虫个体和10 ml试验溶液，盖上盖子以防止水分蒸发。在恒温培养箱中培养，pH（7.5±0.2），投喂椭圆小球藻密度为4×106个/ml，温度和光照条件同预培养。在试验开始后6、24、48、96 h，用解剖镜观察轮虫的存活情况，及时挑出并记录个体死亡数，轮虫死亡判定标准为其头冠纤毛停止摆动且各器官组织停止活动[7]。试验重复3次。

采用作图计算法[8]分别求出不同时间段的半致死浓度24 h LC50、48 h LC50、96 h LC50及其95%可信限，并计算出安全浓度（SC=0.1×24 h LC50 ） [9]。

1.2.2 轮虫对氨氮胁迫的抗氧化生理响应试验。

1.2.2.1 轮虫在不同氨氮浓度条件下的抗氧化生理响应。设定1个对照组和5个试验组，氨氮质量浓度分别为0、1.5、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/L，每组设置3个平行重复。试验在玻璃缸（38 cm×24 cm×24 cm）中进行，每个玻璃缸里加入3 L含有相应氨氮浓度和椭圆小球藻密度为2×106个/ml的轮虫培养液，用加热棒控制水温、用日光灯控制光照、用NaOH和HCl控制pH，环境条件同“1.2.1”。轮虫培养24 h后分别取样，轮虫样品用生理盐水润洗、过滤，滤纸吸干水分。准确称量后，在冰冷的研钵中用质量体积1∶9的匀浆介质制成组织匀浆，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液待用。采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，按照说明书测定轮虫H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。采用苏州科铭生物技术有限公司购买的试剂盒，按照说明书中的方法测定轮虫H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。

1.2.2.2

轮虫在不同氨氮胁迫时间条件下的抗氧化生理响应。氨氮质量浓度设定为12.3 mg/L （24 h LC50），分别在试验开始后0、3、12、24 h的4个时间点取样。试验条件、指标测定和方法均与“1.2.2.1”相同。

1.2.3

数据统计与分析。

分别计算各平行重复试验组的平均值和标准误，试验数据用SPSS19.0统计软件进行Duncan′s单因子多重方差分析，分析氨氮处理组与对照组间的差异显著性。其中，*表示组间差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 氨氮浓度对轮虫的急性毒性

从表1可以看出，随着氨氮浓度从0 mg/L逐渐增加到30 mg/L，萼花臂尾轮虫的死亡率总体上呈增加趋势，在胁迫6、12、24、48 h和96 h各时间段的萼花臂尾轮虫的死亡率与环境氨氮浓度的相关系数分别为0.959 2、0.923 5、0.965 3、0.956 4和0.958 5，均具有很好的线性关系。对表1的数据作直线回归处理，得出24 h轮虫死亡率与氨氮浓度的回归方程：y=50.915x-5.535（R2=0.965 3），从而计算出萼花臂尾轮虫的24 h半致死氨氮浓度（24 h LC50）值为12.3 mg/L，95%置信区间为9.8～15.5 mg/L；同理得出48 h轮虫死亡率与氨氮浓度的回归方程为：y=65.008x-3.708 7（R2=0.903 1） 和48 h LC50为6.7 mg/L，95%置信区间为5.6～8.0 mg/L；96 h轮虫死亡率与氨氮浓度的回归方程为y=69.694x+18.891（R2=0.991 1） 和96 h LC50为2.8 mg/L，95%置信区间为2.3～3.3 mg/L。根据公式安全浓度（SC）=24 h LC50×0.1，计算出萼花臂尾轮虫对氨氮的安全浓度（SC）为 1.23 mg/L。

2.2 不同浓度氨氮对轮虫体内H2O2含量的影响

在氨氮胁迫24 h后，萼花臂尾轮虫体内产生的H2O2含量随着氨氮浓度的升高呈逐渐增加的趋势（图1A）。当氨氮浓度大于或等于2.5 mg/L时，其H2O2含量均显著高于对照组（P<0.05）。在12.3 mg/L氨氮（24 h LC50）的胁迫环境中，萼花臂尾轮虫体内的H2O2含量随着胁迫时间的延长而逐渐增加（图1B）。在胁迫12h和24 h后，萼花臂尾轮虫体内H2O2含量均显著高于对照组（P<0.05）。

2.3 不同浓度氨氮对轮虫体内SOD活性的影响

在氨氮胁迫24 h后，萼花臂尾轮虫体内SOD活性随着氨氮浓度的升高呈逐渐减小的趋势（图2A）。当氨氮浓度大于或等于1.5 mg/L时，其SOD活性均显著低于对照组（P<0.05）。这说明氨氮对轮虫体内SOD活性有较强的抑制作用。从图2B可以看出，在12.3 mg/L（24 h LC50）的氨氮脅迫的环境中，萼花臂尾轮虫体内SOD活性随着胁迫时间的延长而逐渐减小。在胁迫12 h和24 h后，其体内SOD活均显著高于对照组（P<0.05）。

2.4 不同浓度氨氮对轮虫体内CAT活性的影响

从图3可以看出，随着环境氨氮浓度的升高以及同一氨氮浓度（12.3 mg/L）下胁迫时间的延长，萼花臂尾轮虫体内的CAT活性呈现先增加再减小的变化趋势。当氨氮浓度为1.5 mg/L和2.5 mg/L以及同一氨氮浓度处理3 h和12 h时，CAT活性与对照组相比均无显著差异（P>0.050）。氨氮浓度大于或等于10 mg/L时CAT活性显著低于对照组（P<0.05）；当12.3 mg/L氨氮胁迫处理24 h时，CAT活性均显著低于对照组（P<0.05）。

2.5 不同浓度氨氮对轮虫体内MDA含量的影响

从表4可以看出，随着环境氨氮浓度的上升以及同一氨氮浓度（12.3 mg/L）下胁迫时间的延长，萼花臂尾轮虫体内的MDA含量呈现逐渐增加的变化趋势。当氨氮浓度大于或等于2.5 mg/L以及同一氨氮浓度下胁迫12 h和24 h时，其MDA含量均显著高于对照组（P<0.05），表明其体内的脂质氧化程度显著增加。

3 讨论与结论

生物体均存在抗氧化防御系统来清除内源代谢或外源不良刺激而产生的过量活性氧自由基，其中一些酶类能够被氧化应激诱导，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等对清除氧自由基起到关键作用。SOD可催化O2-生成H2O2，从而清除O2-，而H2O2由CAT催化生成水和氧气。研究表明，氨氮胁迫初期生物机体受到刺激会产生过量的氧自由基，此时的抗氧化系统可生成更多的SOD和CAT等抗氧化酶对其做出响应，从而消除氧自由基。但是，随着胁迫浓度的升高以及作用时间的延长，机体抗氧化系统已不足以达到清理大量氧自由基的能力，从而使氧自由基在体内大量累积并影响SOD和CAT的进一步合成，表现出抗氧化酶活性逐渐降低，并且过量的氧自由基发生过氧化反应，最终生成可间接反映组织和细胞造成损伤程度的氧化产物丙二醛（MDA）[10]。笔者通过测定萼花臂尾轮虫在不同氨氮浓度和时间胁迫条件下体内H2O2含量和SOD、CAT活性以及MDA含量的变化，能在一定程度上反映其机体内抗氧化生理响应的过程和氧化损伤程度。该试验结果表明，在水温（25±l） ℃和pH（7.5±0.2）的环境条件下，氨氮对萼花臂尾轮虫的24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50分别为12.3、6.7和2.3 mg/L。然而，萼花臂尾轮虫对氨氮胁迫的抗氧化生理响应更加敏感。当氨氮浓度达到1.5 mg/L 时轮虫体内24 h内的SOD活性显著下降（P<0.05）；氨氮浓度升高至2.5 mg/L 时，轮虫体内24 h内H2O2和MDA含量均出现显著升高（P<0.05）。尽管氨氮2.5 mg/L浓度下24 h内轮虫体内清除H2O2的CAT活性尚未出现显著下降（P>0.05），但可能由于GPX等其他抗氧化酶活性的降低和其他非酶类抗氧化物质的下降，仍然导致了轮虫体内过氧化物和过氧化产物的积累，表明氨氮引起的过氧化反应已对轮虫的生物膜造成了一定程度的破坏。这些引起轮虫抗氧化生理指标出现显著变化的氨氮浓度阈值均远低于24 h LC50值，表明氨氮对萼花臂尾轮虫的毒害作用可能是首先产生氧自由基并过量积累，进而破坏其抗氧化防御体系，最终导致过氧化物积累和机体一定程度的伤害。但是，只有当氨氮浓度继续升高和胁迫时间延长才能引起机体伤害加剧甚至死亡。轮虫体内的SOD酶较易被氨氮损伤，导致其活性下降，从而影响对体内氧自由基的清除；轮虫在氨氮12.3 mg/L的胁迫条件下，其SOD活性、CAT活性分别在12 h和24 h出现显著下降（P<0.05）以及H2O2、MDA含量均在12 h出现显著升高（P<0.05）的试验结果也佐证了这一推论。采用SOD活性和H2O2、MDA含量的指标检测氨氮对萼花臂尾轮虫急性毒性比24 h LC50、48 h LC50和96 h LC50指标更加灵敏。

氨氮对水生生物毒害作用的机制较为复杂，有人认为可能与氨氮对血液载氧能力的抑制有关[11]；也有人认为高浓度的氨氮会对动物体内酶的催化作用和细胞膜的稳定性产生严重影响，进而破坏排泄系统和渗透平衡[12]。该试验结果表明，随着氨氮浓度的升高和胁迫时间的延长，导致活性氧的积累和抗氧化酶系统的破坏以及脂质过氧化的加剧，这可能是氨氮对萼花臂尾轮虫产生毒害作用的重要原因。这与氨氮对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[13]、福瑞鲤（Cyprinus carpio）[14]、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）[15] 、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）[9]等其他生物机体的毒害机制相似，但其具体作用机理还需通过进一步研究。

氨氮是富营养化水体的重要污染因子之一，我国湖泊富营养化的评价标准中富营养化湖泊的总氮含量大于1.2 mg/L（温度20 ℃，pH 7～9）[16]。我国地表水环境质量标准（GB38382002）规定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ类水质的氨氮限值分别为0.153、0.53、1.03、1.53和2.03 mg/L。因此，从萼花臂尾轮虫24 h LC50得到的安全浓度为氨氮1.23 mg/L可以初步判定，Ⅳ类水质的氨氮浓度仍然是萼花臂尾轮虫相对安全的生存环境条件。但是，由于轮虫体内24 h 内H2O2和MDA含量也均在氨氮浓度2.5 mg/L 时出现显著升高，因而在氨氮浓度高于2.03 mg/L的劣Ⅴ类水质环境条件下，会影响萼花臂尾轮虫的生存和生长。在水产养殖和轮虫培育系统中，氨氮更是主要的常见毒性物质之一。在水产养殖和轮虫培育生产上为了培养浮游生物（轮虫的天然饵料），往往一次性大量施肥或一次性大量泼洒豆浆等轮虫饲料，如果再加上换水量小、淤泥过厚、水温过高等不利因素，会导致水体氨氮的不断积累，水体的氨氮浓度可从0.27 mg/L逐漸上升到31.90 mg/L[17]。水体高浓度的氨氮环境必然对轮虫的生理和生长繁殖产生极为不利的影响，最终会出现大批死亡，这可能是导致轮虫培养最终失败甚至泛池的原因之一。

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